BiG专栏｜结构细节决定成败，论双抗设计！

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医药局中人 · 02期 

实验室可以随心所欲的改造抗体的结构，但往往很多细节决定成败

撰文 | 医药局中人
排版 | 搬砖小社

重组蛋白技术的高速发展，我们可以随心所欲的改造抗体的结构，双特异性抗体绝对是最有代表性的例证。我们看到了数百个结构设计，同时衍生出了三特异性，四特异性抗体等。

在热情高涨做结构的时代，我们需要冷静的思考，只有两款双特异性抗体正在临床使用的现状Blinatumomab（Amgen，CD3XCD19, FDA2014年批准），emicizumab（Roche，凝血因子IXa(Fib)×FX， FDA2017年批准）。Catumaxomab，2009年欧盟批准，2017年退市，现重启上市之路。

60年的双特异性抗体发展之路

【图片来源于参考文献1】

除了要设计千姿百态的Format，我们还需要考虑双特异性抗体药物设计的更多细节，如分子大小，两个靶抗体scFv的链接顺序，空间位置等。

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双特异性抗体生物学功能

为了更好理解双特异性抗体的结构意义，我们先看设计双特异性抗体，期望实现的生物学功能。双特异性抗体的生物学功能主要可以分为以下六类：

双特异性抗体六类生物学功能

【图片来源于文献2】

• 受体激活。双特异性抗体模拟天然配体，结合并激活细胞上的受体，引起信号传导，产生后续功能改变。

• 受体阻断，即抑制可溶性配体或者膜结合配体。双特异性抗体阻断相应配体和受体的结合，阻断病理性的信号通路。经典案例：免疫检查点双特异性抗体（信达PD-1/LAG-3；中山康方：PD-1/CTLA-4；泽璟LAG-3/TIGIT等）。

• 受体内化。受体内化对于ADC药物是必须的。对于某些双特异性抗体如含EGFR靶点的，可以增强作用。

• 受体成簇。如靶向TNF受体超家族（TNFRSF）的激动性双抗，诱导受体成簇，才能激活受体，启动下游胞内信号，产生相应生物学功能。

• 受体交联。经典案例是罗氏的Hemlibra(emicizumab)。

• 双细胞结合，重新定向效应细胞。经典案例：重定向NK细胞（CD16X…）,通过ADCC产生细胞毒性作用，国内布局较少。重定向T细胞双特异性抗体（T cell bispecifics ，TCB；CD3X…），占据了50%双抗管线，经典药物：Amgen的Blincyto (blinatumomab)。

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结构设计不容忽略的细节

抗体的空间大小

APC细胞诱导T细胞的激活，需要形成免疫突触（immune synapse ，IS)。突触的核心是cSMAC (central supramolecular activation cluster)，由TCR，共刺激信号CD28，当然也有免疫检查点PD-1等。

APC和T细胞之间的距离约为13-15nm，当距离大于15nm时，T细胞活化就大幅下降。因而T细胞重定向的双特异性抗体（TCB）需要考量，通过TAA抗体拉近的肿瘤细胞和CD3抗体拉近的T细胞，二者之间的距离是否小于15nm，是否能够形成有效的免疫突触。已经有研究显示，当分子大小为4-13nm时可以很好的进入免疫突触，在32nm以上就被排除在免疫突触之外。

对于激动性抗体/双抗，我们需要考虑将分子大小控制在15nm以内。对于阻断性抗体，稍有不同，比如CTLA-4结合B7,形成的突触在14nm。当阻断性抗体将这个距离拉到到15-19nm时，CLTA-4就不能结合B7，达到阻断的目的。

TCB双特异性抗体，分子大小应在15nm以内

【图片来源于文献3】

两个靶向抗体在双抗链接的位置

依旧以T细胞双特异性抗体（TCB）为例。

T细胞招募双特异性抗体：相同的靶向抗体，不同Format的几何结构，产生不同的效力。

在分子大小相同（均在15nm以内的情况下），CD3和TAA在双特异性抗体的位置，与效价高度相关。

TAA和CD3不同链接位置对效力的影响

【图片来源于文献3】

A：TAA抗体分别连接在CD3抗体N段和C端。结果连接在N端比连接在C端，效力高20倍以上（原因：TCR和TAA距离越近，效力越高）。

B：单价靶向肿瘤的IgG脚手架链接CD3-scFV，-Cis（二者在同侧），-Trans （二者在两侧）。Cis结构效价高于-Trans结构。（原因：TCR和TAA距离越近，效力越高）。

C：左边tandem scFv结构（blinatumomab），右侧DART scFV结构。二者分子量及序列相同。区别，tandem结构，TAA和CD3连在一个链上；DART结构，TAA和CD3是两条链，由C端类二硫键铰链结构相连。但是DART的细胞毒性是tandem的60倍。可能机理：DART结构更稳定，有助于双细胞更好结合。

D：尽管分子量一样，序列相同，结构接近，抗体结合能力相同，但是肿瘤抑制能力变异较大。原因，可能这种结构太僵硬，不同朝向会形成不同的空间位阻，会影响效应T细胞发挥功能。

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结语

双抗管线中50%布局了含CD3的T细胞双特异性双抗，国内最近布局了大量免疫检查点双抗。在设计双抗Format时，需要考量不同format产生的分子大小。激动性TCB，希望CD3和TAA尽可能接近，以拉近肿瘤细胞和免疫细胞。而阻断性免疫检查点双抗，则尽快将肿瘤细胞和免疫细胞距离增大超过19nm。不同目的，不同结构，不同连接顺序，都是我们需要考虑的技术细节，也是决定效力，不可忽视的细节。

不同Format在各个文章中已有详述，本文未作细述。

当然双抗还有很多结构细节需要在设计和工艺中进行仔细考量，后续，我们也会陆续进行阐述。

 相关阅读：BiG X 吴辰冰｜全民双抗潮背后的陷阱和弯路！

主要参考文献

1. Aran F Labrijn，Bispecific antibodies: a mechanistic review of the pipeline，Nat Rev Drug Discov . 2019 Aug;18(8):585-608

2. Lee JY, Lee HT, Shin W, Chae J, Choi J, Kim SH, et al. Structural basis of checkpoint blockade by monoclonal antibodies in cancer immunotherapy. Nat Commun 2016;7:13354.

3. S. Dickopf et al.Format and geometries matter: Structure-based design defines the functionality of bispecific antibodies，Computational and Structural Biotechnology Journal 18 (2020) 1221–1227

4. Moore PA, Zhang W, Rainey GJ, Burke S, Li H, Huang L, et al. Application of dual affinity retargeting molecules to achieve optimal redirected T-cell killing of B cell lymphoma. Blood 2011;117:4542–51.

BiG 专栏作者

医药局中人‖ 混迹体外诊断，生物制药十数年，渴求疾病诊疗突破，终生愿做医药局中人。

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